如何防止聚丙烯酰胺垂直電泳漏膠現(xiàn)象已成為實驗室研究人員比較頭疼的問題！

 1. 固定玻璃板時，先將厚薄玻璃板在桌面對齊后在垂直面上稍微向厚板傾斜20度，使底面薄板略高于厚板。

 2. 將固定好的玻板固定于放有海綿墊的制膠架上，固定時用手稍用力往下壓，此時封閉的灌膠系統(tǒng)準備完畢。

 3. 除了以上安裝技巧外，由于海綿橡膠墊用久后會老化或者損壞，從而導致漏膠的現(xiàn)象時常發(fā)生，建議用戶可以購買粘性高柔軟性好的橡膠墊。

常見問題及分析 

1. 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？

 在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以，pH對整個反應體系的影響是重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。

 2. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

 3.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。

 4. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

 5. 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

 處理辦法：加樣前離心；選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

 6. 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

 主要是樣品不溶性顆粒引起的。

 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

7. 什么是“鬼帶”，如何處理？

 “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。

 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

 8. 為什么溴酚藍不能起到指示作用？

 我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

9. 為什么電泳的條帶很粗？

 電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

 處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；

 10. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

 這種現(xiàn)象一般初學者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 

11. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？ 

這主要出現(xiàn)在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。

12. 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？

 通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。 

13. 電泳時間比正常要長？

 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。

 14.分離膠加上后為什么要立即加水？

 加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

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